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多個研究領(lǐng)域依賴于稀有細胞的分離，例如從人血中分離循環(huán)腫瘤細胞 ( CTCs )、從母體樣本中分離胎兒細胞，或在分離低豐度的GFP陽性轉(zhuǎn)染細胞。在這些情況下，傳統(tǒng)流式細胞分選儀的高系統(tǒng)壓力 ( >20psi ) 會對損害目標細胞的完整性和活性。高死體積會造成樣本損失，稀有細胞的數(shù)量本身就非常有限，這無疑是雪上加霜。此外，高度專業(yè)化的設(shè)備和技術(shù)人員，增加了操作的成本和復雜性。
單細胞柔性分選系統(tǒng)Pala基于微流控技術(shù)，流式細胞術(shù)和液滴分配技術(shù)?？稍趲追昼妰?nèi)將單個細胞分選并分離到96或384孔板中。低系統(tǒng)壓力 (<2psi ) 可確保輕柔分選，并保持細胞活力和完整性。為單細胞分選和分離提供了快速、簡單的解決方案。
01. 實驗步驟
> 稀有細胞富集
將HEK-293細胞以0.002%的比例混入到無熒光SP2/0細胞中 ( 2.8μL HEK-293細胞加入到500uL SP2/0中) 制備模擬稀有細胞群。在此細胞群中，預計有10個FITC信號值大于100的HEK-293細胞。進行富集時，利用FITC通道作為觸發(fā)器，觸發(fā)值為100。其它設(shè)門參數(shù)參照各組的分析數(shù)據(jù)。
96孔板A1孔預先加入150μL培養(yǎng)基進行富集細胞收集。在富集過程中，將1μL的一滴液滴到載玻片上，在顯微鏡下檢測陽性細胞的比例，發(fā)現(xiàn)一滴中總共含有10個細胞，其中一個呈GFP陽性。將富集后A1孔中樣品 ( 少于200μL ) 轉(zhuǎn)移至新芯片中，用100μL培養(yǎng)基清洗兩遍A1孔，并將清洗液同樣轉(zhuǎn)移至新芯片中。
> 對富集后稀有細胞分離
利用單細胞分選模式分選單個熒光細胞，將前向散射光 ( FSC ) 通道作為激發(fā)器，激發(fā)水平為FSC50。為排除芯片之間的微小差別，將FITC下限設(shè)為90而不是之前的100，其它設(shè)門數(shù)據(jù)參照之前的設(shè)置。單個GFP陽性細胞分布到預加150μL培養(yǎng)基的96孔板中。單個細胞利用顯微鏡進行驗證，克隆培養(yǎng)14天。
02. 實驗結(jié)果
（1）模擬稀有細胞樣本包含500,000個SP2/0細胞和僅有10個GFP陽性HEK-293細胞 ( 0.002% ）。富集后，目標群體在分離池中的頻率為10%，增加了5000倍。
（2）通過明場和熒光顯微鏡檢查，確認從富集中恢復了7個GFP陽性HEK-293細胞，富集效率為70%。
（3）在單細胞分離后，96孔板中識別出7個中的4個GFP陽性HEK-293細胞，單細胞分離效率為40%。14天的單細胞擴增確認了GFP陽性細胞的克隆增殖。
03. 單細胞柔性分選系統(tǒng)Pala的優(yōu)勢
（1）溫和的操作條件：在低壓環(huán)境下操作 (＜2psi )，這有助于保護細胞的完整性和活性，避免因高壓造成的細胞損傷。
（2）靈活的分離模式：單細胞分離模式，富集分離模式，大量細胞分離模式，滿足不同應用需求。
（3）高效的分離速度：僅需1min即可完成將單細胞分離至96孔板中，6min可實現(xiàn)分離至384孔板。
（4）極低的死體積：近乎零的死體積，這有助于最大限度地減少樣本損失，特別是在處理稀有或珍貴的細胞樣本。
（5）適用于小樣本量：即使從很少的細胞開始 ( 如100個細胞 )，單細胞分配器也能夠進行有效的分離和分配。
總之，單細胞柔性分選系統(tǒng)Pala的兩步法實現(xiàn)稀有細胞分離，為傳統(tǒng)細胞分選儀器提供了一種經(jīng)濟高效的替代方案，這種低壓系統(tǒng)保留了分離細胞的完整性和活性，利于分離的克隆細胞健壯生長。
* 本文轉(zhuǎn)載自「ProteinSimple」微信公眾號
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